400-6027-270
产品信息
产品名称 |
产品编号 |
规格 |
Cas9(H840A) Nickase |
KSG3427-50PMOL |
50 pmol |
产品简介
本产品Cas9(H840A) Nickase，是野生型Cas9 Nuclease(SpCas9)（含有两个切割活性中心）的单点突变突变体，通过突变使其丧失一个切割活性中心，从而实现在与sgRNA靶序列所在的DNA单链上产生切口，形成功能性的单链断裂。Cas9(H840A) Nickase如果配合一对gRNA使用，同样可以实现Cas9 Nuclease相同的双链断裂效果。
用途：体外gRNA引导特定双链DNA中单链断裂、或双链DNA断裂等。
来源：Streptococcus pyogenes来源，大肠杆菌重组表达。
纯度及浓度：SDS-PAGE检测纯度≥95%，无RNase残留，无非gRNA依赖的DNase残留，1 μM。
失活或抑制：65℃条件下5 min完全失活。
酶储存缓冲液：10 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 50%(v/v) glycerol，pH 7.4。
Cas9 Reaction Buffer(10х)：500 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 100 mM MgCl2, 1 mg/mL BSA, pH 7.9。
图1. Cas9 Nickase(D10A或H840A)酶活性效果图。反应体系：20 μL ddH2O、3 μL Cas9 Reaction Buffer (10х)、3 μL 300 nM gRNA (Target sequence：5'-TGCGGTAAAGCTCATCAGCG-3')、1 μL Cas9 Nickase (分别为2、1、0.5、0.25 pmol)，25℃预孵育15 min（CT表示体系用1 μL Nuclease-free water代替Cas9 Nickase）。然后加入3 μL 30 nM的pET28a质粒，37℃孵育15 min后用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。由图中可以看出gRNA与Cas9 Nickase结合后，引导后者至pET28a与gRNA互补处导致单链DNA断裂。
储存与运输
冰袋（wet ice）运输；-20℃保存，12个月有效。
组成
Component Number |
Component |
KSG3427-50PMOL |
KSG3427-1 |
Cas9(H840A) Nickase |
50 μL |
KSG3427-2 |
Cas9 Reaction Buffer(10х) |
1 mL |
说明书 |
1份 | |
操作步骤
1. 准备好体外消化反应各种试剂[将Cas9(H840A) Nickase、gRNA、底物DNA、Cas9 Reaction Buffer于冰浴上，gRNA稀释至300 nM，底物DNA稀释至30 nM]；
2. 配制反应体系（以30 μL体系为例）：
Reagent |
Volume |
Nuclease-free water |
20 μL |
Cas9 Reaction Buffer(10х) |
3 μL |
gRNA(300 nM) |
3 μL |
Cas9(H840A) Nickase(1 μM) |
1 μL |
Total Reaction Volume |
27 μL |
3. 涡旋混匀后室温离心数秒，使液体聚于管底，25℃预孵育10 min；注：反应体系中可以加入终浓度1U/μL的RNase Inhibitor，防止RNase污染（相应减少Nuclease-free water体积维持反应总体系不变）。
4. 再向体系中加入3 μL 30 nM的底物DNA（终体积30 μL），轻轻混匀后离心沉淀液体，37℃孵育15 min，反应时间可以根据实际情况适当延长30-120 min；
5. 反应结束后，每个样品中加入1 μL蛋白酶K（20 mg/mL，货号KSG1234-1ML）室温孵育10 min（或65℃热处理5-10 min）；
6. 反应体系可以直接用适当浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如不立即电泳，可以将体系置于-20℃备用。
注意事项
1. 本产品使用需注意RNase-free、DNase-free相关操作，所用试剂耗材都应保证Nuclease-free。
2. 酶制品使用时应放在冰盒内或冰上，建议分装使用，使用完毕后应立即置于-20℃保存。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
（产品包装升级中，以实物为准。）
需要技术支持？
如果您有任何问题或如果您在实验过程中遇到问题，或需要更详细的技术指导，请联系我们的技术支持团队
400-6027-270
联系我们
如果您对我们的公司或产品有任何疑问，欢迎随时联系我们
湖北省武汉市东湖新技术开发区高新二路388号生物医药加速器22栋5楼 
400-6027-270 
鄂公网安备42018502008544号